12mar

JPCR CMV citomegalovírus quantitativo

O Citomegalovírus (CMV), membro da família de Herpes vírus humano, é um patógeno com genoma linear de dupla fita que pode infectar vários tipos de células e, portanto, responsável por uma infinidade de complicações clínicas.

Dependendo do tecido e do estado imunológico do paciente, o CMV pode causar infecção de três formas diferentes: infecção aguda com alta replicação e grande quantidade de vírus, infecção persistente com baixos níveis de replicação e infecção latente na qual a replicação viral está estagnada.

O mecanismo da reativação do vírus é ainda desconhecido assim, o CMV é um dos patógenos mais oportunistas, que acomete principalmente pacientes transplantados sendo uma importante causa de morbidade e mortalidade.

A PCR para CMV quantitativo

O exame realiza a detecção pela PCR em Tempo Real, através de sondas e primers específicos. O DNA do CMV é extraído das amostras e é amplificado pela PCR.

O resultado ou produto da amplificação é detectado por meio de uma sonda específica, um fragmento do DNA que existe apenas no CMV, marcada com corante fluorescente. O produto é quantificado por meio da comparação com a curva padrão gerada, possibilitando a determinação da carga viral. O exame conta com um controle Interno que funciona como validador da extração/amplificação para cada amostra.

O limite de detecção é a menor quantidade de cópias do alvo que pode ser detectada pelo exame com uma probabilidade de 95%. O limite de quantificação foi determinado através da medição da linearidade, a faixa dinâmica e a reprodutibilidade. Os limites da faixa dinâmica são os limites mínimo e máximo da quantificação. Os limites de detecção e quantificação, do exame são:

– Limite de detecção   0,57 cópias/μL, ou seja, o kit consegue amplificar amostras que contenham 1 única cópia do DNA viral, permitindo a sua quantificação.

– Limite máximo de quantificação     200.000 cópias/μL (2×105 cópias/μL)
– Limite mínimo de quantificação      1 cópia/μL

O que é e como funciona a curva padrão?

O kit para PCR de CMV, vem com 1 amostra, chamada de padrão, que contém 60.000 cópias do DNA do vírus, ou seja, uma amostra conhecida. Esse padrão é então diluído para chegar nas concentrações 6.000, 600, 60, e 6 cópias. Durante a amplificação do padrão que ocorre juntamente com as amostras dos pacientes há a geração de uma curva padrão. Uma vez que a diluição é seriada e o fator de diluição é 1:10 para cada ponto, os pontos na curva-padrão devem ser dispostos linearmente.

O ciclo em que cada amostra iniciou a amplificação indica a quantidade de material viral existente, ou seja, quanto mais DNA viral presente na amostra, menor o número de ciclos necessários para iniciar a amplificação. E quanto menor a quantidade de DNA do vírus presente na amostra, maior a quantidade de ciclos necessários para iniciar a amplificação. O threshold é utilizado para indicar o início da amplificação do DNA viral e serve para quantificar o material existente inicialmente na amostra.

Com o resultado da quantificação é possível avaliar em qual estágio está a infecção:


Com o resultado da quantificação é possível avaliar em qual estágio está a infecção:

Infecção aguda – com alta replicação e grande quantidade de vírus/DNA viral;

Infecção persistente – com baixos níveis de replicação, pouco DNA detectado;

Infecção latente – a replicação viral está estagnada, ou seja, a quantidade de DNA nas amostras não aumenta.

Há alguns fatores que podem interferir no exame gerando falsos resultados:

– Amostras colhidas em tubos com anticoagulante incorreto;

– Amostras de pacientes que utilizam heparina

– Amostras hemolisadas e/ou lipêmicas

– Amostras com resíduos de fibrinas.

O resultado das amostras é liberado nas Segundas, Quartas e Sextas.

12mar

Os exames micológicos são solicitados em caso de suspeita de infeção fúngica. Existem diversos exames para detectar a presença de fungos em amostras clínicas. Dentre a rotina de exames solicitados destacamos a pesquisa e a cultura.

A cultura: procedimento em que a amostra é cultivada em meios específicos que estimulam o crescimento dos fungos e leveduras. Caso ocorra o crescimento fúngico é necessário realizar o microcultivo em lâmina utilizando um meio que estimula a formação de estruturas reprodutivas permitindo a identificação correta da espécie caso a mesma esporule. Como é necessário realizar a cultura e o microcultivo o prazo para entrega do resultado é de até 30 dias.

A ausência do pedido de cultura no exame micológico não permite a identificação da espécie fúngica e pode ocasionar erros analíticos em razão da baixa quantidade de células ou fragmentos de hifas na amostra coletada. É importante estar atento que o pedido de pesquisa de fungos não contempla a cultura, assim é necessário solicitar os dois exames quando se quer ter a certeza do diagnóstico e da espécie responsável pela infecção.

A atenção a coleta é fundamental aos exames micológicos uma vez que os fungos podem apresentar baixa quantidade de células no local da infecção. A recuperação das células fúngicas difere das células bacterianas, quando comparadas, pois as mesmas tem um crescimento mais lento por serem células mais complexas.

Os códigos disponíveis para estes exames são FUNGPE (fungos somente pesquisa) e FUNGWI (Pesquisa + Cultura).

12mar

A tipagem do HLA, identificação molecular dos genes do sistema HLA do indivíduo, se dá através de exames de média e alta resolução. Os genes do sistema HLA coordenam a produção das proteínas de membrana HLA, estas são essenciais para a regulação do sistema imunológico adaptativo.

Há vários grupos de genes HLA: A*, B*, C* (classe I), DQ*, DR* (classe II), e outros. Esses genes, estão presentes em todas as células nucleadas humanas e participam da identificação e resposta imunológica a substâncias estranhas ao organismo, ou seja, aos antígenos.

Cada indivíduo apresentam um sistema polimórfico complexo e único, fazendo com que os tecidos e orgãos contenham genes e proteínas HLA diferentes daqueles encontrados em outra pessoa, apenas gêmeos univitelinos possuem genes e proteínas iguais.

Quando uma pessoa precisa receber um órgão por meio de um transplante é necessário que esses genes e proteínas sejam o mais semelhantes possível, ou seja, histocompatibilidade – compatibilidade entre os tecidos, para que o transplante tenha mais sucesso e não haja rejeição e perda do órgão.

A avaliação do grau de histocompatibilidade entre duas pessoas, compreende a análise genética molecular dos genes HLA (também chamada de tipagem HLA), o resultado de ambas as pessoas é comparado e assim definido o grau de histocompatibilidade, que quanto maior melhor.

O exame define o gene (A, B, C, DQ, DP ou DR, ou um grupo desses) seguido de um asterisco e o número que representa o grupo de alelos, em seguida dois pontos (:) e os números que representam a proteína específica, quando apresenta alta resolução.

O resultado de doador e receptor de transplante são comparados avaliando se são semelhantes e o quanto são semelhantes. O sequenciamento é o padrão ouro com o qual é possível atingir o máximo de informações.

A tipagem HLA pode ter baixa/média resolução: Quando identifica o grupo de gene(s) que pertence(m) a classe I – HLA: A* ou  B*ou  C*, ou genes da classe II – DQ*ou DR ou DP*, identificando ainda o grupo alélico.  Exemplo: HLA-A*02

A tipagem HLA pode ter alta resolução: Quando se identifica(m) o(s) alelo(s) do(s) gene(s), ou seja, A*02:01, DRB1*01:03, DQA1*01:02.

O exame pode compreender um gene apenas, um grupo, ou vários genes HLA. Outros números podem ser adicionados para indicar outras particularidades de cada análise gênica.

Exemplo de resultado:  HLA-A*02:101:01:02N


HLA       prefixo

A           gene

*           separador

02       grupo alélico

:           separador de campo

101         proteína HLA específica

01     indica substituição que não altera o aminoácido

02       indica diferenças em regiões que não geram proteína(não-codificante)


N    sufixo usado para denotar mudanças na expressão

Há nomenclaturas internacionais utilizadas que podem se visualizadas em https://hla.alleles.org/nomenclature/naming.html

11mar

O Vírus Sincicial Respiratório VSR ou do inglês RSV, é um vírus respiratório da família Paramyxoviridae que geralmente causa sintomas leves semelhantes ao resfriado. O VSR causa infecção aguda do trato respiratório principalmente em recém-nascidos e crianças de até dois anos, podendo infectar indivíduos de outras idades. O tempo de recuperação para a maioria das pessoas se dá em uma ou duas semanas. Entretanto o VSR pode ser grave, especialmente em bebês e idosos. Segundo a OMS o VSR é a causa mais comum de bronquiolite (caracterizado pela inflamação das pequenas vias aéreas no pulmão) e pneumonia (infecção dos pulmões) em crianças menores de 1 ano de idade.

As crianças com maior risco de doença grave pelo VSR são:

• Bebês prematuros; • Bebês, especialmente os de 6 meses ou menos; • Crianças menores de 2 anos com doença pulmonar crônica ou doença cardíaca congênita (presente desde o nascimento); • Crianças com sistema imunológico enfraquecido; • Crianças com distúrbios neuromusculares, incluindo aquelas com dificuldade para engolir ou limpar as secreções de muco.

Alguns cuidados são necessários para evitar a infeção pelo VSR:

• Lave as mãos com frequência; • Manter as mãos longe do rosto; • Evitar o contato próximo com pessoas doentes; • Cobrir a boca e nariz em caso de tosse e espirros; • Limpar e desinfetar superfícies como brinquedos e maçanetas; • Ficar em casa quando estiver doente. Isso também ajudará a proteger outras pessoas de contrair a doença.

O Laboratório São Paulo, disponibiliza o exame: Pesquisa rápida para antígeno do Vírus Sincicial Respiratório. O teste de antígeno para VSR tem boa aplicação durante os períodos de elevação de casos de síndromes respiratórias, como o que estamos vivenciando neste momento, e por se tratar de uma infecção mais comum em extremos de idades, em crianças e idosos, auxilia na definição de conduta clínica. O teste de antígeno para VSR apresenta excelente grau de sensibilidade, tendo sua aplicação, tanto para casos sintomáticos, como assintomáticos. O resultado fica disponível em até 30 min após a chegada do material na área técnica. O valor de referência para esse exame é: não-detectado.

OBS: Este exame somente é coberto pelos planos de saúde para pacientes hospitalizados mediante solicitação especial ao convênio, diretriz de utilização 130. Casos fora dessas condições serão tratados como solicitação e pagamento particular.

11mar

Um resultado rápido pode auxiliar no diagnóstico de infecções respiratórias e agilizar o manejo clínico do caso avaliado. Realizamos internamente o painel molecular de patógenos respiratórios, respondendo com agilidade e eficiência à demanda de todos os profissionais de saúde que precisam ter o resultado em mãos no menor tempo possível.

O setor de biologia molecular conta com uma equipe treinada e eficiente para atender as necessidades do mercado utilizando novas tecnologias com foco na qualidade e precisão dos resultados. O Painel de Patógenos Respiratórios é um teste de diagnóstico in vitro realizado por PCR – Reação em Cadeia da Polimerase em Tempo Real – para detecção qualitativa e diferencial de vírus e bactérias.

No painel molecular respiratório é possível detectar 24 patógenos, agentes infecciosos como: influenza A, influenza A – subtipo H3, influenza A – subtipo H1N1, influenza B, Adenovírus, Bocavírus, Coronavírus Humano 229E, Coronavírus HKU-1, Humano Coronavírus OC43, Coronavírus Humano NL63, Coronavírus SARS, Coronavírus Sars-CoV-2, Enterovírus, Metapneumovírus, Parainfluenza 1, Parainfluenza 2, 3 e 4, Rinovírus, Vírus Sincicial ou subtipo A, vírus sincicial ou subtipo pertussis, Bordetella parapertussis e Mycoplasma pneumoniae.

As infecções virais e bacterianas avaliadas neste painel tendem a ser mais graves em pacientes idosos, crianças nos primeiros anos de vida e em pacientes imunocomprometidos, podendo em alguns casos causar pneumonia e bronquiolite.

O resultado é divulgado em até 48 horas, após a chegada do material na área técnica. O teste tem boa aplicação no período de aumento de casos de síndromes respiratórias e possui excelente grau de sensibilidade com aplicação tanto em casos sintomáticos quanto assintomáticos.

O resultado do painel molecular respiratório deve ser avaliado por um clínico em conjunto com a avaliação dos sintomas do paciente.

11mar

No laboratório São Paulo todos os cuidados e recomendações sugeridas pela Sociedade Internacional de Hemostasia e Trombose são seguidas Importância de um laudo descritivo: Como a pesquisa do anticoagulante lúpico deve ser realizada e interpretada: Testes de rastreamento/triagem (screening): A ideia aqui é utilizar testes coagulométricos onde as concentrações de fosfolípides sejam mínimas com diferentes ativadores (pelo menos dois).

Um teste de triagem alterado significa que a razão entre o paciente e o controle é maior ou igual a 1,20, isto é, existe um prolongamento do tempo até a formação da fibrina do paciente em relação ao controle maior ou igual a 20%. Quando isso acontece temos duas interpretações: deficiência de algum fator ou a presença de algum inibidor da coagulação.

Uma vez que a triagem está alterada o próximo passo e a realização do ensaio de mistura. Ensaio de mistura: A utilização de uma mistura de um pool de plasma de pessoas normais ou um calibrador que contenha níveis conhecidos de fatores da coagulação nos permitem separar se o alargamento do TTPa ou do TVVRd são causados pela deficiência de fatores, uso de antagonistas da vitamina K ou pela presença de inibidores da coagulação. Nos dois primeiros casos o teste vai normalizar com a adição do pool/calibrador e na presença de inibidores os testes permanecerão alargados. Os mesmos valores de corte da triagem são utilizados, a razão entre o paciente e o controle é maior ou igual a 1,20 (relação paciente/controle maior ou igual a 20%).

Podemos interromper neste ponto a pesquisa do anticoagulante lúpico caso haja correção dos tempos, isto é, se a razão entre o paciente e o controle estiver menor que 1,20. Este resultado sugere a deficiência de fatores, seja esta congênita ou adquirida (uso de varfarina, hepatopatia grave, coagulação intravascular disseminada…) Entretanto se a correção dos tempos não ocorrer estamos diante da presença de algum inibidor da coagulação. Os anticoagulantes orais diretos (Apixabana, Rivaroxabana, Edoxaban, Dabigatrana), as heparinas não fracionadas e de baixo peso molecular além a fondaparinux podem se comportar como inibidores da coagulação neste caso.

Obviamente, a presença de inibidores contra os fatores da coagulação (mais comuns, inibidores de FVIII ou IX) e o anticoagulante lúpico vão manter o ensaio de mistura alargado. Fica então indicado seguir para o teste confirmatório.

O confirmatório vai responder à pergunta sobre quem está mantendo alargado o ensaio de mistura. Adicionamos fosfolípide na reação que se manteve alargada após a realização da mistura. A correção dos testes aponta para a existência de um inibidor fosfolípide dependente, o anticoagulante lúpico.

A não correção nos indica a existência de outro inibidor da coagulação. É importante lembrar que as heparinas e os DOACs podem funcionar como inibidores da coagulação não fosfolípides dependentes.

É extremamente importante que todos os passos realizados estejam visíveis no laudo com seus tempos e razões descritas, além da interpretação do que aconteceu em cada um deles. Ver os tempos e correlacionar com os controles nos ajuda na interpretação dos resultados. Além disso no final do laudo uma conclusão tem que estar claramente descrita, presença ou ausência do anticoagulante lúpico