JPCR CMV citomegalovírus quantitativo
O Citomegalovírus (CMV), membro da família de Herpes vírus humano, é um patógeno com genoma linear de dupla fita que pode infectar vários tipos de células e, portanto, responsável por uma infinidade de complicações clínicas.
Dependendo do tecido e do estado imunológico do paciente, o CMV pode causar infecção de três formas diferentes: infecção aguda com alta replicação e grande quantidade de vírus, infecção persistente com baixos níveis de replicação e infecção latente na qual a replicação viral está estagnada.
O mecanismo da reativação do vírus é ainda desconhecido assim, o CMV é um dos patógenos mais oportunistas, que acomete principalmente pacientes transplantados sendo uma importante causa de morbidade e mortalidade.
A PCR para CMV quantitativo
O exame realiza a detecção pela PCR em Tempo Real, através de sondas e primers específicos. O DNA do CMV é extraído das amostras e é amplificado pela PCR.
O resultado ou produto da amplificação é detectado por meio de uma sonda específica, um fragmento do DNA que existe apenas no CMV, marcada com corante fluorescente. O produto é quantificado por meio da comparação com a curva padrão gerada, possibilitando a determinação da carga viral. O exame conta com um controle Interno que funciona como validador da extração/amplificação para cada amostra.
O limite de detecção é a menor quantidade de cópias do alvo que pode ser detectada pelo exame com uma probabilidade de 95%. O limite de quantificação foi determinado através da medição da linearidade, a faixa dinâmica e a reprodutibilidade. Os limites da faixa dinâmica são os limites mínimo e máximo da quantificação. Os limites de detecção e quantificação, do exame são:
– Limite de detecção 0,57 cópias/μL, ou seja, o kit consegue amplificar amostras que contenham 1 única cópia do DNA viral, permitindo a sua quantificação.
– Limite máximo de quantificação 200.000 cópias/μL (2×105 cópias/μL)
– Limite mínimo de quantificação 1 cópia/μL
O que é e como funciona a curva padrão?
O kit para PCR de CMV, vem com 1 amostra, chamada de padrão, que contém 60.000 cópias do DNA do vírus, ou seja, uma amostra conhecida. Esse padrão é então diluído para chegar nas concentrações 6.000, 600, 60, e 6 cópias. Durante a amplificação do padrão que ocorre juntamente com as amostras dos pacientes há a geração de uma curva padrão. Uma vez que a diluição é seriada e o fator de diluição é 1:10 para cada ponto, os pontos na curva-padrão devem ser dispostos linearmente.
O ciclo em que cada amostra iniciou a amplificação indica a quantidade de material viral existente, ou seja, quanto mais DNA viral presente na amostra, menor o número de ciclos necessários para iniciar a amplificação. E quanto menor a quantidade de DNA do vírus presente na amostra, maior a quantidade de ciclos necessários para iniciar a amplificação. O threshold é utilizado para indicar o início da amplificação do DNA viral e serve para quantificar o material existente inicialmente na amostra.
Com o resultado da quantificação é possível avaliar em qual estágio está a infecção:
Com o resultado da quantificação é possível avaliar em qual estágio está a infecção:
Infecção aguda – com alta replicação e grande quantidade de vírus/DNA viral;
Infecção persistente – com baixos níveis de replicação, pouco DNA detectado;
Infecção latente – a replicação viral está estagnada, ou seja, a quantidade de DNA nas amostras não aumenta.
Há alguns fatores que podem interferir no exame gerando falsos resultados:
– Amostras colhidas em tubos com anticoagulante incorreto;
– Amostras de pacientes que utilizam heparina
– Amostras hemolisadas e/ou lipêmicas
– Amostras com resíduos de fibrinas.
O resultado das amostras é liberado nas Segundas, Quartas e Sextas.
